توالی‌یابی سنگر یا Sanger Sequencing روشی برای تعیین دقیق توالی نوکلئوتیدی DNA است که توسط فردریک سنگر در سال ۱۹۷۷ توسعه یافت. این روش، انقلابی عظیم در زمینه ژنتیک و زیست‌فناوری ایجاد کرد و همچنان به عنوان یکی از معتبرترین و دقیق‌ترین روش‌ها برای بررسی توالی ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
اصول پایه‌ای توالی‌یابی سنگر
در روش توالی‌یابی سنگر، DNA تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده می‌شود. این روش بر اساس ترکیبی از نوکلئوتیدهای طبیعی (dNTP) و نوکلئوتیدهای نشاندارشده (ddNTP) است که به صورت تصادفی در زنجیره DNA قرار گرفته و باعث توقف سنتز می‌شوند. این امر سبب ایجاد قطعات DNA با طول‌های مختلف می‌شود که می‌توانند با الکتروفورز تفکیک شده و توالی دقیق DNA را مشخص کنند.
مراحل انجام توالی‌یابی سنگر
۱. آماده‌سازی نمونه
نمونه DNA مورد نظر ابتدا به صورت تک‌رشته‌ای درآمده و پرایمرهای مخصوص به ناحیه‌ای که می‌خواهیم توالی‌یابی کنیم متصل می‌شوند.
۲. واکنش توالی‌یابی
DNA پلیمراز، نوکلئوتیدهای معمولی و نشاندارشده را به رشته الگو اضافه می‌کند. با اتصال ddNTP ها که فاقد گروه ۳-هیدروکسیل هستند، ادامه سنتز DNA متوقف می‌شود.
۳. الکتروفورز و تحلیل داده‌ها
قطعات ایجادشده با استفاده از الکتروفورز موئین یا ژل آگاروز جداسازی شده و بر اساس اندازه مرتب می‌شوند. سپس با کمک ابزارهای تحلیل داده، توالی دقیق نوکلئوتیدی مشخص می‌شود.
کاربردهای توالی‌یابی سنگر
توالی‌یابی سنگر به دلیل دقت بالا و قابلیت اعتماد فراوان در زمینه‌های مختلفی کاربرد دارد:
۱. تشخیص جهش‌های ژنتیکی
از مهم‌ترین کاربردهای این روش، شناسایی و تأیید جهش‌های ژنتیکی در بیماری‌های ارثی و اختلالات ژنتیکی است.
۲. تأیید نتایج سایر روش‌ها
از این روش معمولاً به عنوان روشی تأییدی برای اعتبارسنجی نتایج به دست آمده از روش‌های پیشرفته‌تر مانند NGS استفاده می‌شود.
۳. تعیین توالی قطعات کوچک DNA
برای توالی‌یابی دقیق و سریع قطعات کوتاه DNA، سنگر همچنان روشی ایده‌آل است.
۴. کاربردهای پزشکی قانونی
در پزشکی قانونی و بررسی‌های جنایی برای تعیین هویت افراد یا شناسایی بقایای انسانی استفاده می‌شود.
مزایا و معایب توالی‌یابی سنگر
مزایا
- دقت بسیار بالا
- قابلیت اعتماد بالا برای تأیید نتایج
- مناسب برای قطعات کوتاه DNA
معایب
- هزینه بالا در مقایسه با تکنولوژی‌های جدید
- سرعت پایین برای توالی‌یابی گسترده
- نامناسب برای بررسی‌های ژنومی گسترده
مقایسه توالی‌یابی سنگر با توالی‌یابی نسل جدید (NGS)
توالی‌یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing یا NGS) با قابلیت توالی‌یابی موازی هزاران توالی به طور همزمان، جایگزین مناسبی برای سنگر در مطالعات گسترده ژنومی است. با این حال، به دلیل دقت بسیار بالای سنگر، این روش همچنان به عنوان استاندارد طلایی برای تأیید نتایج توالی‌یابی NGS باقی مانده است.
نکات کلیدی در توالی‌یابی سنگر
- انتخاب پرایمرهای مناسب برای منطقه هدف
- خلوص و کیفیت نمونه DNA
- استفاده از معرف‌ها و کیت‌های استاندارد برای کاهش خطا
پیشرفت‌ها و آینده توالی‌یابی سنگر
با وجود ظهور تکنولوژی‌های جدید، توالی‌یابی سنگر به دلیل دقت بالایش در برخی از کاربردها همچنان جایگاه خود را حفظ کرده است. توسعه اتوماسیون در این روش و پیشرفت در سیستم‌های تحلیلی داده‌ها به کاهش هزینه‌ها و بهبود کارایی آن کمک کرده است.
توالی‌یابی سنگر برای توالی‌های کوتاه با دقت بسیار بالا استفاده می‌شود در حالی که NGS برای مطالعات گسترده ژنومی با قابلیت بررسی هزاران قطعه DNA به طور همزمان کاربرد دارد.
به دلیل دقت بالای آن در تشخیص جهش‌های دقیق و تأیید نتایج حاصل از دیگر تکنولوژی‌ها مانند NGS، این روش همچنان کاربرد دارد.
هزینه این روش معمولاً بالاتر از NGS بوده و برای قطعات کوتاه DNA مناسب‌تر است
توالی‌یابی سنگر عمدتاً برای تشخیص جهش‌ها، بررسی دقیق توالی‌های کوتاه و کاربردهای پزشکی قانونی به کار می‌رود.
جمع‌بندی
توالی‌یابی سنگر یکی از دقیق‌ترین و معتبرترین روش‌ها برای شناسایی دقیق توالی DNA است. با وجود هزینه و زمان بالای آن نسبت به روش‌های مدرن، همچنان در کاربردهای تشخیصی و پژوهشی اهمیت فراوانی دارد. در وبسایت ngsiran.com می‌توانید با جزئیات بیشتر درباره کاربردها، مزایا و مقایسه این تکنولوژی با NGS اطلاعات کسب کنید.